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上海微分过问对比(DIC)显微镜是若何工作的?

2024-02-02(12306)次浏览

  微分过问对比(DIC)显微镜是若何工作的?DIC显微镜是一种使用偏振滤光器和沃拉...

微分过问对比(DIC)显微镜是若何工作的?

DIC显微镜是一种使用偏振滤光器和沃拉斯顿棱镜的传统宽视场显微镜。

光源散发出的光会穿过滤光器,造成45°的偏振光。在穿过沃拉斯顿棱镜后,光会被分成垂直偏振分量,其中一个为0°偏振,另一个为90°偏振。聚光镜将光荟萃在标本上,再由2束偏振角度分歧的连贯平行光线照射到标本上。光线穿过分歧的光路长度,由于其穿过样本的蹊径上可能存在厚度或折射率差距。
最后的了局是,一条光线相对于另一条光线出现相移。垂直偏振光通过物镜和另一个沃拉斯顿棱镜后,沉新组合成135°偏振光。凭据光路长度的分歧,这两束光线的滋扰会产生建设性(增亮)或粉碎性(变暗)滋扰,使得正本用明场显微镜险些观察不到的结构此刻可通过DIC显微镜观察到。
最后,偏振滤光器(也称为分析仪)会将未产生任何相移的直接透射光滤除,其只允许135°的偏振光通过。

微分过问对比 (DIC) 显微镜

使生物标本的未染色通明结构可见,这些结构在明场照明下难以看到

用DIC造影剂成像的神经元。Neurons_imaged_in_DIC.jpg

本文诠氏缢当使用显微镜对通明、未染色的生物标本进行成像时,微分过问对比 (DIC) 若何成为明场照明的优良代替规划。标本的明场图像通常不足结构和细节,由于部门吸收光的强度变动很幼。染色的确会在通过标本后引起光强度的差距,但染色通?赡苁怯卸镜。DIC显微韭符用光程长度和相移的梯度,使通明结构可见。

带有偏振光的浮雕状图像

未染色的标本在明场显微镜中通?雌鹄床幌匝矍蚁附诓患。但现实上,它们与能干的光相互作用,并产生人眼无法检测到的相移。染色会导致振幅偏移和通过的光强度的差距,但大无数情况下,这仅合用于死资料。引起光波振幅变动的标本或其结构称为振幅物体[1]。

微分过问对比(DIC)显微韭符用光程长度和相移的梯度,使相位物体在用显微镜观察时可见[2]。当光通过期引起相移的标本或其结构称为相位物体[1]。通过这种方式,能够以足够的对比度和分辨率观察活细胞和生物体。DIC产生类似浮雕的图像,其中标本的结构和特点似乎投下了阴影。它们没有光晕伪影,并且由于光学切片的可能性,也能够对相对较厚的标本进行成像。

DIC显微镜技术最早由弗朗西斯·史女士(Francis Smith)于1947年发现,但随后由乔治·诺马尔斯基(Georges Nomarski)于1952年进一步发展并成为实用的显微镜步骤[2]。

对于DIC显微镜,仅使用偏振光来照亮标本。偏振光分散成两条分歧的光线,它们位于偏振的正交平面上。这两条光线彼此极度靠近。当它们在样品内以分歧的方式经历折射或散射时,就会产生分歧的相移。若是这些光线沉新组合,它们会互有关扰。光此刻是椭圆偏振的。这衷飓振能够通过度析仪转换为振幅偏移。通过这种方式,能够使波长在1/200(使用相机时甚至为1/1000波长)与整个波长之间的波长差距的相移可见。

在明场中成像的神经元。明场DIC公司在DIC中成像的神经元。

图 1:使用明场和 DIC 对比度成像的神经元。

光波的振荡

对于非偏振光,光波相对于其传布轴在所有方向上振荡。然而,在线性偏振光中,所有波振荡都拥有一样的偏振角度或偏振平面。圆极化是另一种可能的极化类型。光波振荡遵循圆周运动并拥有不变的值,而方向则以恒定的角速度变动。椭圆偏振光是线性偏振光和圆偏振光的混合物。

偏振光能够由称为偏振器的资料或设备产生。若是类似的组件用于确定振动平面,则称为分析仪。有吸收式偏振片和分束偏振片。

偏振光示例:线性、圆周或椭圆偏振波(玄色)的组成,由线性偏振分量(红色和灰色)叠加而成。图 2:偏振光示例:线性、圆周或椭圆偏振波(玄色)的组成,由线性偏振分量(红色和灰色)叠加而成。

DIC显微镜中的光路

在DIC显微镜中,偏振光是通过搁置在聚光镜前面的偏振器产生的。这衷飓振光通过DIC棱镜割裂成两条拥有垂直偏振平面的线偏振光,DIC棱镜更广为人知的是沃拉斯顿棱镜。沃拉斯顿棱镜能够在聚光镜的平面上找到。尺度的沃拉斯顿棱镜由双折射资料的两个楔块造成,它们在其底座上粘合在一路,并且光轴平行于表表表并相互垂直。

在沃拉斯顿棱镜的部门,45°偏振光被分成两条垂直的偏振光线,角度别离为0°和90°(左)。棱镜的第二部门随后凭据偏振扭转它们的色散(右)。两条光线在通过聚光镜后变得平行。图 3:在 Wollaston 棱镜的部门中,45° 偏振光被分成两条垂直偏振光线,角度别离为 0° 和 90°(左)。棱镜的第二部门随后凭据偏振扭转它们的色散(右)。两条光线在通过聚光镜后变得平行。

通过该棱镜的偏振光被剪切成两个距离很近的波,拥有分歧的偏转角度:通常波和非凡波。它们拥有垂直的偏振平面,对于这两个波,介质的行为就如同它现实上拥有单个折射率一样。波前的剪切产生在位于两个棱镜之间折射率结点的过问平面上。光波在空间上被剪切角分隔。对于整个棱镜上所有匹配的光波,它们的方向和它们之间的距离是一样的。这两个波之间的空间必须幼于显微镜的分辨率极限。

因而,试样被缜密距离的光波对照亮,这些光波与横向位移平前进入。若是这两种光波与拥有分歧折射率或分歧厚度的试样部门相互作用,则当它们从试样中出现时,它们的光程长度会有所分歧。光程长度是光路上两点之间的折射率和厚度的乘积。它与传输功夫和光速有关。由于光程长杜纂光的传输功夫有关,因而两个匹配的光波之间会产生相移。

在光波穿过标本后,它们通过另一个沃拉斯顿棱镜沉新荟萃在一路。此刻它们互有关扰,形成椭圆偏振光,而后通过度析仪。只有拥有显著偏振平面的光能力通过,因而,对于分歧的光波会产生分歧的振幅。相移被转换为振幅偏移,从而导致天生的图像中拥有分歧的光强度。

对于现代DIC显微镜,沃拉斯顿棱镜时时被批改。一个例子是Nomarski棱镜。它也由两个双折射楔块组成,但只有一个楔块与沃拉斯顿棱柱中的楔块一样。另一个是批改的,光轴是倾斜定位的。这种差距导致位于棱镜之表的过问面。因而,棱镜能够位于物镜的孔径平面之表,使DIC更易于使用。

对于DIC显微镜,相邻物体点的相移差距有助于图像的形成。试样的细节在折射率或厚度方面拥有梯度,能够更清澈地显示出来。由于光束彼此垂直偏振,因而通过旋转显微镜载物台能够看到图像的差距。

在进行DIC显微镜查抄时,请务必记住不要使用塑料基材、载玻片或盖玻片和标本,由于很多聚合物对光拥有去偏抖擞用,并且经;崤で员榷。

非偏振光通过偏振滤光片,而后以 45° 偏振。

图 4:非偏振光通过偏振滤光片,而后以 45° 偏振。通过渥拉斯顿棱镜后,光被分离成垂直的偏振分量,一个偏振度为0°,另一个偏振度为90°。随后,聚光镜将光线疏导通过样品。样品由两条拥有分歧偏振的有关平行光线照射。这根基上会产生两个略微偏移的样品明场图像,一个是 0°,另一个是 90° 偏振光。由于光的偏振分歧,这些图像不会产生建设性或粉碎性滋扰。分离的光线经历分歧的光程长度,由于它们穿过样品的点的厚度或折射率可能存在差距。这导致一条射线与另一条射线相比产生相移。垂直偏振的光线穿过物镜后,以135°沉新组合成一条偏振光。凭据光程长度的差距,两种光线的过问此刻会导致标本区域变亮或变暗,从而使结构看起来在明场照明下险些看不到。最后,直接透射的光(没有产生任何相移)被 135° 偏振滤光片(也称为分析仪)去除。

幼鼠纤维成体(结缔组织细胞)、Transdescantia(野花)和 Micrasterias(绿藻)的 DIC 图像。图5(从左到右):幼鼠纤维质体(结缔组织细胞)、Transdescantia(野花)和Micrasterias(绿藻)的DIC图像。器拥有分歧割裂角度的 Wollaston 棱镜纪录的秀丽隐杆线虫(蛔虫)的 DIC 图像。图6:器拥有分歧割裂角度的沃拉斯顿棱镜纪录的秀丽隐杆线虫(蛔虫)的DIC图像。


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